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叶挺、项英二人在新四军创建初期的合作还是很愉快的。他们在新四军的改编、组建、集整训等工作中，有过密切的配合。这一时期，他们的分工很明确，叶挺主要管外，跟国民党打交道，争取港澳和海外侨胞的支持，军内工作则侧重军事训练、作战指挥。项英主要管内，与党中央、东南分局的直接上级长江局打交道，军内主要抓干部配备、党的建设等。
叶挺、项英的分歧，是从怎样执行党中央有关迅速挺进敌后，独立自主发展游击战争这个决策开始的。叶挺认为这一决策具有重要的战略意义，非常正确，应该及早执行，但项英对此犹豫不决。令叶挺最难以接受的是，对这类与军事作战密切相关的问题，项英在与中央磋商的过程中，根本不征求他这个军事首长的意见，也不向他通报中央的有关指示，好像这是什么“党内机密”，对他这个“党外人士”和“统战对象”需要保密。叶挺的处境是困难的，正如陈毅在《一九三八年至一九四三年华中工作总结报告》中说的一句十分尖锐且贴切的话：“项英对叶挺军长不尊重，不信任，不让其独任军部的工作，一直到包办战场指挥，强不知以为知。”
项英不仅在军事上不尊重叶挺，在日常工作和生活方式上，对叶挺也颇多微词。叶挺到部队视察时，喜欢以马代步，带的副官、参谋、卫士等随行人员也比较多，前呼后拥一大帮。项英到部队去则习惯于轻车简从，所以他认为叶挺是摆官架子，旧军人作风，不符合红军官兵一致的作风。叶挺仪表堂堂，穿着整洁，平时不是穿黄呢将军服，就是穿皮夹克、西装等便衣，很少穿新四军的深灰色制式军装。项英则剃光头，无论冬夏，新四军制式军装不下身，隆冬时节也只是穿一件旧棉大衣。叶挺单独吃小灶，还从广东带来一个厨师。他的交际活动较多，常叫他的厨师做些广东客家名菜，邀请军部领导同志、来访的国内外人士、国民党三战区驻新四军的联络参谋，以及随他来新四军工作的老朋友一起聚餐。项英也被邀去吃过一两次，但后来感到“不妥”，就再也没去过。项英对此颇有微词，认为这不是无产阶级的生活作风。
叶挺是一个自尊心极强、性格极倔强的人。广州起义失败后他不服从中央李立三和驻共产国际代表王明的压制，愤然脱党出走，就是这种性格的典型反映。叶挺的这一瑕疵，在他出任新四军军长前夕，几乎淹没了他过去的光荣和贡献。项英一看到叶挺，就用有色眼镜看他：“他对党对**还能忠诚吗？”“他能接受党的领导吗？”这些想法，中共中央领导人开始也有过，项英也知道毛主席、党中央开始对叶挺并不信任，可是经过面谈和一段时间的观察，中共中央对叶挺已经完全信任。可项英的思想一直没有转过弯来，一直把叶挺作为统战对象来看待。所以在新四军中出现了军长的命令，需要副军长批准的怪现象。
叶挺在实行党委负责制的新四军内，职权行使难免受到一些限制。作为党在新四军的最高领导人，项英无视党中央的重托，始终以关门主义的态度对待叶挺，与叶挺的关系搞得非常僵，加之叶挺无法出席某些会议和看不到党中央的指示电报，在工作时心情不愉快，甚至产生了想摆脱项英离开新四军的想法。
一九三八年六月初，叶挺为继续解决新四军的经费问题，来到武汉。他向驻汉的中共中央长江局领导周恩来、叶剑英等汇报工作，倾诉了自己虽是军长却又有职无权的苦衷，并建议成立一个共同议事的新四军委员会，以解决这一问题。对于叶挺的困难处境，周恩来和叶剑英很同情，也很理解他的心情。他们当天便向延安发了一个电报，请求中央批准叶挺的建议。
党中央很重视叶挺的意见，很快作了批复，回电表示“同意组织新四军委员会，项英为主任，叶挺为副主任”。但由于项英对此抱有抵触情绪，新四军委员会虽然成立了，但实际上并没有发挥多大作用。叶挺依然没有发言权。自尊心很强的叶挺感到难于忍受，遂致电长江局，表示准备辞去新四军军长职务。八月二十八日，王明、周恩来、博古复电表示挽留：“项英赴延安开会，新四军工作请你实际负责。待会议结束后，我们拟去一人帮助检查整理新四军工作。”九月，项英去武汉述职，随后又由武汉去延安参加中共六届六中全会，叶挺遂离军出走，回到广东老家。
在广东期间，叶挺接受执掌广东大权的余汉谋的邀请，准备出任东江游击司令。但对于这一任命，中央认为不妥。中央认为，华中的战略地位比华南更重要，若叶挺不回新四军，势必引起蒋介石的不满，从而影响国共两党的统战关系。中央通过在粤的廖承志，将这个指示传达给了叶挺。叶挺的出走，在国民党方面也引起很大的反响。十二月，在西安开会的蒋介石召见八路军驻西安办事处主任林伯渠时说：“是你们共产党排挤、打击叶挺，逼他出走与辞职。这样一位优秀人才都不能与你们合作，将无人能与你们合作。”国民党当局扬言，将对新四军采取两种办法：一是另派更难相处的军长；二是改新四军为游击队，减少军款2万。
在这种情况下，刚参加完中共六届六中全会、接替王明出任中共中央南方局书记的周恩来一回到重庆，便发电报请叶挺返渝。鉴于此，叶挺只好回到了重庆。周恩来把党中央希望叶挺留在华中发挥更大作用的意见，再次面告叶挺。叶挺表示，愿意顾全大局，但仍有与项英难以相处的种种顾虑，不愿再回皖南。他问周恩来，可不可以让他到八路军去直接带兵打仗，如可以，不论到哪个师，担任何种职务，他都愿意。
周恩来紧握叶挺的手，内疚地说：“我代表毛主席同志向你赔礼道歉。项英给你的工作带来诸多不便，真对不起你。”针对叶挺想去八路军的想法，周恩来明确指出，华中战略地位非常重要，而且经两党商定的新四军军长职务，不好随意变动。同时告诉叶挺，经过他的建议，党中央同意新四军委员会改由叶挺任正职，项英为副职。军事工作多交叶挺办理，项英实际为政委。并在全军再次进行教育，确立叶挺的军长权力。对项英在新四军发展方针和内部团结方面所犯错误，党中央很重视，正在设法纠正。鉴于项英在六中全会上对王明右倾投降主义错误态度暧昧，中央对他在会后能否在新四军中贯彻执行会议精神很是担心，故授权周恩来在适当的时候到皖南去一趟，就新四军贯彻六中全会的决议和解决叶、项矛盾等问题，给予指导和推动。
一九三九年二月，周恩来来到皖南云岭新四军军部。为了保证党的六届六中全会确定的战略方针在新四军中真正得到贯彻，他在军部进行了许多重要活动。由于项英对于党中央早在一九三八年五月便已决定的新四军向东向北发展的战略方针，始终抱着将信将疑、既执行又打折扣的错误态度，而是总想实施他自己的向南发展的想法，因此周恩来此行还负有重申党中央的正确战略方针，纠正项英在这方面错误的重要责任。为调解叶、项关系，周恩来向新四军领导人传达了中共中央关于叶挺工作安排的重要意义，就由来已久的叶、项关系问题批评了项英。周恩来专门指出：“中央认为叶挺作为党外人士是暂时的，这对国共合作更为有利，如果不是考虑这一点，他的党籍问题很容易解决的。”周恩来要求项英主动地采取团结叶挺的具体行动，并严肃指出：团结叶挺是新四军内部团结的关键所在，这是一件大事，如果处理不好，就要犯错误。
对于周恩来这些富于原则性与情感的耐心劝导、批评，项英表示愿意接受。他在周恩来主持的军部领导人会议上，作了洋洋万言的自我批评，主动提出将军事指挥权、军事干部的安排权交给叶挺。
七月底，叶挺回到了皖南。这次叶挺回来之后，项英主动向叶挺表示友好，工作上尽量做到多和叶挺商量，生活上也有所关照，隔三差五还到叶挺那里，和他一起吃顿小灶，有时饭后还要下几盘象棋。
叶挺为了顾全大局，也做出了友好的姿态。经过一番思考，叶挺给自己定下了行动准则：凡属自己职权范围的事情，应该做而又能够做的，一定要努力做好；凡属叶、项两人职权范围的事情，自己应该做，但项英不采纳他的意见，或不愿让他多参与的，那就满足项英“大主意由我来拿”的欲望，让他去决定。
项英为了执行中共中央有关尊重叶挺地位、职权的指示和表示自己的坦诚，所有电文都送叶挺过目，由两人联合签署，并将自己与中共中央的分歧告诉了叶挺。对于中共中央早已确定的新四军向东、向北发展的指导思想，项英一开始并不积极，犹豫不决。出于对军部安全的殷切关怀，中共中央屡次致电项英，提出“皖南军部以速移苏南为宜”。刘少奇、陈毅、粟裕等同志也纷纷给项英发电报、写信，劝他早下决心，争取主动，尽快把军部迁往江北或苏南。但项英由于长期从事游击战争，害怕东进、北上深入敌后无山地依托，难以生存与发展，仍然下不了移动决心。他给中央发了不少很长的电报，还是强调移动有困难，有危险。
叶挺认为，中共中央立足全局提出的军部转移的要求，及时而重要，应当坚决执行，不应从中作梗。他向项英明确表示：他理解党中央的意图，拥护党中央的指示。但叶挺也清楚，自己一个党外人士的意见又能算得了什么？他抱定这样的态度：自己有意见要说明白，项英听不听，那是他的事，他有决定权。
一九四零年十月，国民党第三战区司令长官顾祝同已布置了“围剿”新四军的方案。国民党方面以七个师八倍于新四军的兵力，在贵池�